Madoa ya gramu ni mbinu ya haraka na hutumiwa kuona uwepo wa bakteria kwenye sampuli ya tishu na kuainisha bakteria kama Gram-chanya au Gram-hasi, kulingana na kemikali na mali ya kuta za seli zao. Madoa ya gramu karibu kila mara hutumiwa kama hatua ya kwanza ya kugundua maambukizo ya bakteria.
Mbinu hii ya kupaka rangi imetajwa kwa jina la mwanasayansi wa Kidenmark Hans Christian Gram (1853 - 1938), ambaye aliunda mbinu hiyo mnamo 1882 na kuichapisha mnamo 1884 kama mbinu ya kutofautisha kati ya aina mbili za bakteria zilizo na dalili zinazofanana za kliniki: Streptococcus pneumoniae (pia inajulikana kama Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) na bakteria Klebsiella pneumoniae.
Hatua
Njia ya 1 ya 3: Kuandaa Slide ya Darubini
Hatua ya 1. Jitayarishe kufanya kazi katika maabara
Vaa glavu na tai ya nywele ndefu kuzuia uchafuzi wa bakteria wa sampuli unayojaribu. Safisha nafasi ya kazi chini ya kofia ya moto, au katika eneo lingine lenye hewa ya kutosha. Angalia kichapo cha Bunsen na uhakikishe kuwa darubini inafanya kazi vizuri kabla ya kuanza.
Hatua ya 2. Sterilize glasi ya darubini
Ikiwa slaidi ya glasi ni chafu, safisha kwa maji ya sabuni ili kuondoa mafuta na uchafu. Safisha slaidi na ethanoli, safi ya glasi, au njia nyingine inayotumiwa na maabara yako.
Hatua ya 3. Weka sampuli kwenye slaidi ya glasi
Unaweza kutumia mbinu ya doa ya Gram kusaidia kutambua bakteria katika sampuli ya matibabu, au utamaduni wa bakteria wanaokua kwenye sahani ya petri. Kwa matokeo bora, tumia doa ya Gram kwenye viharusi nyembamba vya sampuli. Inashauriwa kutumia sampuli zilizo chini ya masaa 24, kwani bakteria wakubwa wanaweza kuwa wameharibu kuta zao za seli na hawawezi kujibu madoa ya Gram.
- Ikiwa unatumia sampuli ya tishu, ongeza matone 1-2 kwenye slaidi ya glasi. Panua sawasawa kwenye slaidi ili kuunda safu nyembamba ya kunyunyiza sampuli, kwa kuiteleza ukitumia ukingo wa slaidi nyingine ya glasi tasa. Acha ikauke kabla ya kufanya hatua inayofuata.
- Ikiwa unachukua bakteria kutoka kwa sahani ya petri, sterilize kitanzi cha chanjo kwenye burner ya Bunsen mpaka inang'ae, kisha ruhusu ipoe. Tumia kitanzi kumwagilia maji tasa kwenye slaidi, kisha chaza na baridi tena kabla ya kuitumia kukusanya sampuli ndogo ya bakteria. Baada ya hapo koroga kwa upole.
- Bakteria iliyoandaliwa kwenye mchuzi lazima ichochewe tena kwa kutumia vortexer, kisha ichukuliwe na kitanzi cha chanjo kama hapo juu, bila kuongeza maji.
- Ikiwa una sampuli ya usufi (kawaida hufanywa na mpini mdogo wenye ncha ya pamba), gusa na upole zungusha usufi juu ya slaidi.
Hatua ya 4. Joto la juu kidogo linaweza kutengeneza smear nzuri
Joto litashikilia bakteria juu ya slaidi, kwa hivyo haifutiki kwa urahisi wakati wa mchakato wa kuchafua. Gonga slaidi haraka mara mbili hadi tatu juu ya kichoma moto cha Bunsen, au pasha moto slaidi juu ya hita ya umeme ya slaidi. Usiongeze moto, sampuli inaweza kuharibiwa. Ikiwa unatumia burner ya Bunsen, inapaswa kuwa moto mdogo lakini wa bluu badala ya moto mkubwa wa machungwa.
Vinginevyo, smear pia inaweza kutengenezwa na methanoli, kwa kuongeza matone 1-2 ya methanoli kwenye smear kavu, kukausha methanoli iliyobaki kwenye slaidi kwa kuiacha wazi. Mbinu hii hupunguza uharibifu wa seli na hutoa msingi safi wa picha ya slaidi
Hatua ya 5. Weka slaidi juu ya tray ya kuchorea
Trays za kutengeneza zinafanywa kwa chuma, glasi, au sahani za plastiki zisizo na kina na laini laini iliyo juu. Weka slaidi juu ya nyavu hizi, ili kioevu unachotumia kiweze kuingizwa kwenye tray.
Ikiwa hauna tray ya kuchorea, unaweza kuweka slaidi kwenye tray ya plastiki ili kuchapisha cubes za barafu
Njia ya 2 ya 3: Mchakato wa Stain ya Gram
Hatua ya 1. Mimina kioevu cha rangi ya zambarau juu ya smear
Tumia pipette kunyunyizia sampuli ya bakteria na matone machache ya rangi ya zambarau, pia inajulikana kama gentian violet. Acha kwa sekunde 30-60. Crystal violet (KV) hutengana katika suluhisho la maji ndani ya KV + na ioni za kloridi (Cl-). Ions hizi hupenya kuta za seli na utando wa seli ya bakteria wote wa gramu-chanya na gramu-hasi. Ion ya KV + inaingiliana na vifaa vyenye kuchaji vibaya vya seli za bakteria, na kuzipa seli rangi ya zambarau.
Maabara mengi hutumia zambarau ya "Hucker", ambayo ina oksidi ya amonia kuzuia mvua
Hatua ya 2. Suuza violet ya Crystal kwa upole
Pindua slaidi na utumie chupa ya washer kunyunyizia mkondo mdogo wa maji yaliyosafishwa au bomba kwenye slaidi. Maji yanapaswa kupita juu ya uso wa smear, na haipaswi kunyunyiziwa moja kwa moja kwenye smear. Usifue kupita kiasi. Inaweza kuondoa madoa kwenye bakteria chanya ya Gram.
Hatua ya 3. Suuza smear na iodini, kisha suuza
Tumia dropper kusafisha smear na iodini. Iache kwa angalau sekunde 60, kisha safisha kwa uangalifu kwa njia ile ile hapo juu. Iodini, kwa njia ya ioni iliyochajiwa vibaya, inaingiliana na KV + kuunda kiwanja kikubwa kati ya Crystal violet na iodini (CV-I kiwanja tata) katika tabaka za ndani na nje za seli. Mchanganyiko huu wa misombo utabaki na rangi ya zambarau ya zambarau ya kioo ndani ya seli, katika maeneo yenye rangi.
Iodini ni dutu babuzi. Epuka kuvuta pumzi, kumeza au kuwasiliana na ngozi
Hatua ya 4. Ongeza rangi ya rangi, kisha suuza haraka
Mchanganyiko wa 1: 1 ya asetoni na ethanoli kawaida hutumiwa kwa hatua hii muhimu, ambayo lazima iwekwe kwa uangalifu. Weka slaidi kwa pembe fulani, kisha ongeza rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi ya rangi. Kawaida hii huchukua chini ya sekunde 10, au hata wakati kidogo ikiwa bleach ina mkusanyiko mkubwa wa asetoni. Acha hatua hii mara moja, vinginevyo rangi hiyo pia itachoma rangi ya zambarau kutoka kwa seli zenye gramu-chanya na hasi, na mchakato wa kutia madoa lazima urudishwe. Osha mara moja rangi ya ziada ya rangi ya rangi ukitumia mbinu ya hapo awali.
- Asetoni safi (95% +) inaweza kutumika kama mbadala. Asetoni zaidi unayotumia, bleach itafanya kazi haraka kwa hivyo unahitaji kuzingatia wakati.
- Ikiwa una shida kuweka wimbo wa wakati wa hatua hii, ongeza rangi ya bleach tone kwa tone.
Hatua ya 5. Nyunyiza rangi ya kaunta juu ya smear, kisha suuza
Doa la kaunta, kawaida safranin au fuchsin, hutumiwa kuongeza tofauti kati ya bakteria wa gramu-hasi na gramu-chanya, kwa kuchafua bakteria waliotengwa (decolorized), i.e.bakteria wa gramu-hasi, nyekundu au nyekundu. Acha angalau sekunde 45, kisha suuza.
Fuchsin itatia doa bakteria nyingi hasi za gramu, kama Haemophilus spp na Legionella spp. Njia hii ni nzuri kwa Kompyuta
Hatua ya 6. Kausha slaidi
Unaweza kuyakausha katika hewa ya wazi ili kuyakauka, au kuyakausha kwa kutumia karatasi yenye biburi iliyouzwa kwa kusudi hili. Mchakato wa kudhoofisha gramu umekamilika.
Njia ya 3 ya 3: Kuangalia Matokeo ya Kuchorea
Hatua ya 1. Andaa darubini nyepesi
Weka slaidi chini ya darubini. Bakteria hutofautiana sana kwa saizi, kwa hivyo ukuzaji wa jumla unaohitajika utatofautiana kutoka 400x hadi 1000x. Lens ya lengo na mafuta ya kuzamishwa inapendekezwa kwa picha kali. Dondosha mafuta ya kuzamisha kwenye slaidi, epuka mwendo wakati unachuruzika kuzuia mapovu kutengeneze. Sogeza kipini cha lensi ya darubini ili lensi ya lengo iingie mahali na kugusa mafuta.
Kuzamishwa kwa mafuta kunaweza kutumika tu kwenye lensi zilizoundwa maalum, sio kwenye lensi "kavu"
Hatua ya 2. Jaribu kutambua bakteria chanya na gramu hasi
Chunguza slaidi chini ya darubini nyepesi. Bakteria ya gramu-chanya huonekana zambarau kwa rangi, kwa sababu violet ya kioo imenaswa ndani ya ukuta mnene wa seli. Bakteria ya gramu-hasi itakuwa ya rangi ya waridi au nyekundu, kwa sababu violet ya kioo huwashwa kupitia kuta nyembamba za seli, ambapo rangi ya rangi ya waridi huingia.
- Ikiwa sampuli ni nene sana, matokeo yanaweza kuwa chanya bandia. Weka sampuli mpya ikiwa inaonyesha bakteria zote chanya za gramu, ili kuhakikisha kuwa matokeo ni sahihi.
- Ikiwa unatumia rangi ya bleach nyingi, matokeo yanaweza kuwa hasi ya uwongo. Weka sampuli mpya ikiwa inaonyesha bakteria zote hasi za gramu, ili kuhakikisha kuwa matokeo ni sahihi.
Hatua ya 3. Linganisha matokeo unayoona na picha ya kumbukumbu
Ikiwa haujui bakteria inaonekanaje, soma mkusanyiko wa picha za rejeleo, kawaida hupangwa kwa sura na doa la Gram. Unaweza pia kutazama hifadhidata mkondoni katika [Hifadhidata ya Kinga ya Kinga ya Kinga ya Kiafya ya Kitaifa, Bakteria katika Picha, na tovuti zingine nyingi mkondoni. Ili kuwezesha kitambulisho, hapa chini kuna mifano ya bakteria ambayo kawaida hukutana au muhimu kwa utambuzi, iliyoainishwa kulingana na hadhi na sura ya Gramu.
Hatua ya 4. Tambua bakteria yenye gramu kulingana na umbo lao
Bakteria huainishwa zaidi kulingana na umbo lao chini ya darubini, kawaida kama cocci (spherical) au viboko (cylindrical). Hapa kuna mifano kadhaa ya bakteria wenye gramu (rangi ya zambarau) kulingana na umbo lao:
- Gramu chanya cocci kawaida staphylococci (maana ya kikundi cocci) au streptococci (maana mnyororo cocci).
- Fimbo chanya za Gramu kama Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, na Listeria. Bakteria ya fimbo Actinomyces spp. kawaida huwa na matawi au filaments.
Hatua ya 5. Tambua bakteria hasi wa gramu
Bakteria hasi ya gramu (rangi ya waridi) mara nyingi huwekwa katika vikundi vitatu. Cocci zina umbo la duara, fimbo ni ndefu na nyembamba, wakati fimbo za coccoid ziko katikati.
- Cocci hasi cocci Ya kawaida ni Neisseria spp.
- Fimbo za gramu-hasi k.m E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, na wengine wengi. Vibrio cholerae inaweza kuonekana kama shina la kawaida au shina lililoinama.
- Gramu-hasi "coccoid" (au "coccobacilli") bakteria ya fimbo k.m Bordetella, Brucella, Haemophilus na Pasteurella
Hatua ya 6. Angalia kwa uangalifu ikiwa matokeo yamechanganywa
Baadhi ya bakteria ni ngumu kuchora haswa, kwa sababu ya ukali au asili ya wax ya kuta zao za seli. Bakteria hawa wanaweza kuonyesha mchanganyiko wa zambarau au nyekundu katika seli moja, au kati ya seli tofauti kwenye smear hiyo hiyo. Sampuli za bakteria zilizo zaidi ya masaa 24 zinaweza kuonyesha shida hii, lakini pia kuna spishi zingine za bakteria ambazo hubaki kuwa ngumu rangi wakati wowote wa sampuli. Bakteria hawa wanahitaji vipimo maalum zaidi vya kitambulisho, kama vile kudhoofisha asidi-haraka, uchunguzi katika tamaduni ya bakteria, media ya tamaduni ya TSI, au upimaji wa maumbile.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, na Propionibacterium spp. zote ni bakteria wenye gramu, lakini mara nyingi hazina rangi wazi.
- Bakteria wadogo, wembamba kama vile Treponema, Klamidia, na Rickettsia spp. ngumu kutia doa kwa njia ya Gram.
Hatua ya 7. Tupa matumizi na vifaa vyovyote vilivyobaki
Utaratibu huu wa utupaji taka hutofautiana kati ya maabara na inategemea vifaa vilivyotumika. Kawaida, kioevu kwenye tray ya uchafu hutolewa kwenye chupa zilizochorwa kama taka hatari. Loweka slaidi katika suluhisho la 10% ya bleach, kisha toa kwenye kontena kali.
Vidokezo
- Kumbuka kuwa matokeo ya gramu yatakuwa mazuri ikiwa sampuli ni nzuri. Ni muhimu kuwajulisha wagonjwa ili waweze kutoa mfano mzuri (kwa mfano, tofauti kati ya kutema mate dhidi ya kikohozi kirefu kupata sampuli ya sputum).
- Kama bleach ya rangi, ethanoli humenyuka polepole zaidi kuliko asetoni.
- Kuzingatia kanuni za kawaida za maabara ili kuhakikisha usalama.
- Tumia swab ya shavu kufanya mazoezi, kwa sababu ina bakteria wenye gramu-chanya na gramu-hasi. Ikiwa unaona aina moja tu ya bakteria, unaweza kuwa unatumia bleach kidogo sana au nyingi.
- Unaweza kutumia vifungo vya mbao ili kupata slaidi.
Onyo
- Asetoni na ethanoli ni vitu vinavyoweza kuwaka. Asetoni itaondoa mafuta kutoka kwa mikono yako, na kuifanya iwe rahisi kwa ngozi yako kunyonya kemikali zingine. Vaa kinga na uzitumie kwa uangalifu.
- Usiruhusu smear kukauka kabla ya suuza stain ya Gram au kaunta.
Unachohitaji
- Mfano wa Mtandao
- Slide ya glasi
- Pipette
- Chanzo kidogo cha moto, au hita ya slaidi, au methanoli
- Maji
- Zambarau ya kioo
- Iodini
- Rangi ya bleach, kama vile pombe au asetoni
- Safranin
